Expression and purification of Lassa virus cap-snatching endonuclease

Abstract

La fiebre de Lassa es una enfermedad vírica multisistémica aguda caracterizada por una alta mortalidad. Esta enfermedad es causada por el virus Lassa (LASV), perteneciente al orden de los Bunyavirales y está catalogada por la Organización Mundial de la Salud como una de las ocho enfermedades prioritarias para la investigación y el desarrollo. Los estudios estructurales de las proteínas que participan en el ciclo infeccioso de diferentes virus, han abierto un nuevo mundo de oportunidades terapéuticas. Entre estas, nuevas estrategias antivirales de amplio espectro. Los miembros del orden taxonómico Bunyavirales se caracterizan por presentar genomas segmentados de una sola hebra de ARN con polaridad negativa o ambisentido. Cada segmento está encapsulado por múltiples nucleoproteínas (NP) y unido a una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp), también conocida como proteína L. Hasta ahora, se ha descubierto un dominio de endonucleasa en la región N-terminal de varias proteínas L de Bunyavirales que participan en la transcripción del genoma viral. En este estudio se optimizó las condiciones de purificación del dominio endonuclease de la proteína L de LASV para su posterior uso en estudios estructurales. La purificación se realizó usando un enfoque de dos pasos, una cromatografía de afinidad seguida de una exclusión molecular. Se compararon dos marcadores diferentes para la cromatografía de afinidad, un marcador MBP y uno GST, mostrando el último los resultados más prometedores. Con el fin de optimizar la purificación, se realizó un proceso de ensayo de estabilidad térmica y se determinó que las mejores condiciones de solvente para la purificación es tampón HEPES a pH 7,5 una concentración de sal de NaCl 1 M y MnSO4 5 mM. Se obtuvo una muestra final pura con una concentración de 3,9 mg/ml.